推薦使用多肽純度

多肽是由復雜分子組成的化合物，每一條多肽序列都有其獨特的化學和物理屬性。除了有些多肽合成比較困難之外，大多數多肽是相對容易進行多肽合成的，但是純化可能較困難。很多肽水溶性較差，因此在純化時，這些疏水性多肽常常需要溶解在有機溶劑或者特定的緩沖溶液中。 這些有機溶劑或者緩沖溶液有時并不適合生物學等方面的實驗，所以客戶就不能用這些多肽進行研究工作。 因此，當接到多肽的訂單時，我們會對這些多肽序列進行分析，以確定是否難以合成或水溶性的問題。針對一些有著特殊序列的多肽，我們合成多肽的專業人員經過仔細地分析研究后，會給客戶提出合理的建議。 例如，當遇到難于合成或水溶性差的多肽序列時，我們不會拒絕合成，而是提供客戶一些可以改善的方法，最終使客戶得到滿意的產品，這些方法包括改變序列或其兩端等方面。

a. 縮短序列

一般來講，在合成多肽中多肽肽鏈長度越長，所得到粗肽的純度越低。大多數含有少于30個殘基的多肽比較容易合成。然而，當肽鏈的長度超過50個殘基時，就應該考慮如何才能得到目的肽。多數情況下，縮短肽的長度使其少于50個殘基，能夠達到理想的結果。

如果序列中含有較多的疏水性殘基，多肽就會難于合成。這可能是在合成多肽的過程中，由于多肽側鏈形成β折疊造成不完全耦合所導致。這種情況下，用一些極性殘基來替換一個或多個疏水性殘基，也可以插入一個Gly或Pro，就可以打開β折疊。

如果多肽序列中含有較多的Cys、Met、Arg、Trp殘基時，多肽就會難于合成。因為Cys、Met、Trp或者其側鏈很容易氧化。如果可能的話應盡量避免這些殘基在序列中出現，或者做一些保守的替換。例如，用Ser代替Cys，Norleucine代替Met，Tyr、Phe或其他一些疏水性殘基如Leu代替Trp。Lys可以用來代替Arg。

a. 改變多肽序列的N或C端

對酸性肽（即在中性條件下多肽帶負電荷），我們推薦多肽為這樣的形式：

Acetyl-peptide-COOH（多肽N端乙酰化，C端自由羧基），以使多肽盡可能多的帶負電荷。

對堿性肽（即在中性條件下多肽帶正電荷），我們推薦多肽為這樣的形式：

H-peptide-amide（多肽N端自由氨基，C端酰胺化），以使多肽盡可能多的帶正電荷。

如果多肽序列中疏水性殘基（W、F、V、I、L、M、Y、A）的含量大于50%時，多肽的溶解性顯著降低。此時，延長多肽序列增加的極性殘基往往有助于提高多肽的極性。相反，縮短多肽序列以減少疏水性殘基也能增強多肽的極性。總之，多肽的極性越強，其水溶性越好。

為了改善合成多肽的溶解性，有些多肽序列是可以任意添加一些極性殘基的。我們建議，在酸性肽的N或C端加入Glu-Glu，在堿性肽的N或C端加入Lys-Lys。如果序列中不允許加入帶電基團，我們建議在序列的N或C加入Ser- Gly-Ser。顯然，如果多肽序列兩端都不允許改變的話，這種方法就不適合了。

改變多肽序列中的某些殘基就可以改善多肽的溶解性。一個相對保守又簡單的替換能夠顯著地增強多肽的溶解性，如用Gly代替Ala。

如果想要合成一些連續的或重疊的多肽，應當對每一條多肽的起始點進行適當的改變，使每條多肽序列中的疏水性和親水性殘基達到平衡。或者把“困難”殘基分配到不同的序列中（如，將兩個Cys劃分到兩個序列中，而不要使其出現在在同一個序列里）。

我們無法通過研究多肽的結構來預測其在水中的溶解度。然而，賴氨酸的ε-氨基和精氨酸的胍通常有助于預測溶解度，尤其是短肽。與此相反，含有天門冬氨酸和谷氨酸的酸性肽往往是不易溶于水的，但易溶于稀氨水或堿性緩沖液。另外，多肽計算器（http://rlfedun.com/tool.aspx）的平均親水性，可以對我們提供參考。

多肽的溶解性很大程度上取決于多肽的極性。酸性的多肽溶解于堿性溶液，而堿性多肽可溶解于酸性溶液，含有大量不帶電荷的極性氨基酸殘基或疏水性氨基酸的疏水性多肽和中性多肽可先溶解于少量有機溶劑中，如DMSO、DMF、醋酸、乙腈、甲醇、丙醇或異丙醇，然后加水（蒸餾水）稀釋。含有甲硫氨酸或半胱氨酸的多肽不能用DMSO溶解，因為DMSO可能造成側鏈氧化。 在多肽合成溶解之前先取小部分進行多肽溶解測試，您需要測試幾種不同的溶劑，直到找到最適當的一種。只有當多肽完全溶解后，才能加入溶液并將之稀釋至最終濃度。即先溶解，后加入緩沖液。注意: 多肽合成中總是將多肽加入到適當溶劑中攪拌，而不能采用其它方式。

a. 將每個酸性氨基酸賦值為－1，包括天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）、以及羧基末端-COOH。每個堿性氨基酸賦值為＋1，包括精氨酸（R）、賴氨酸（K）、組氨酸（H）以及氨基末端-NH2。然后計算整個多肽的電荷數。

b. 如果整段肽所帶電荷是陽性的，說明該肽是堿性的。可先嘗試用蒸餾水來溶解；如果不溶于水，接著嘗試用少量10%-25%醋酸溶解，如果仍然失敗的話，添加一些TFA（10-50微升）來增溶，然后用水稀釋至理想濃度。

c.如果整段肽所帶電荷是陰性的，說明該肽是酸性的。酸性的多肽可以嘗試用PBS（PH 7.4）來溶解，如果不溶的話，添加少量的堿性溶劑，如0.1 M的碳酸氫銨，然后加水稀釋至理想濃度。含有游離半胱氨酸的多肽應溶于脫氣的c. 酸性緩沖液中，因為當PH值大于7時，巰基會被迅速氧化成二硫化物。

d. 如果整段肽電荷是零，說明肽是中性的。中性肽通常溶于有機溶劑。首先，嘗試添加少量乙腈、甲醇或異丙醇。對于高度疏水的多肽，可使用少量的二甲基亞砜溶解，然后用水稀釋至理想濃度。對于含有自由半胱氨酸的肽，需使用DMF而不是DMSO。對于有聚集傾向的肽，可添加6M鹽酸胍或8M尿素，然后進行必要的稀釋。 為了防止或盡量減少多肽降解，請將多肽以凍干粉形式保存在-20°C，-80°C更佳。如果需要保存溶液肽，最好分成小樣存放，以避免反復凍融。一份樣品融凍后未用完，應扔掉。細菌降解有時會成為溶液肽的麻煩，所以請將肽溶于無菌水或肽溶液過濾除菌。

堿性氨基酸: K, R, H, N-terminus

酸性氨基酸: D, E, C-terminus

極性中性氨基酸: F, I, L, M, V, W, Y

非極性疏水氨基酸: G, A, S, T, C, N, Q, P, 乙酰基，酰胺基

多肽計算器（http://rlfedun.com/tool.aspx）的平均親水性，可以對我們提供參考。

所有標明“保持凍干”的產物, 經密封包裝可在常溫條件下穩定運輸，溶解狀態的多肽不宜長期保存，需要長期保存的多肽，應以凍干粉形式存放在含有干燥劑的密封容器內，置于-20°C保存，-80°C效果更好，可以最大限度地避免合成的多肽降解。這種儲存方式可以使多肽可保存數年，避免了被細菌降解和氧化，也可以避免二級結構的形成。 當使用冰凍產品時, 在打開包裝和稱重前，請先將多肽在干燥器中平衡至室溫。因多肽往往具有吸濕性，未經平衡到室溫的多肽在打開蓋子后易凝結，從而降低了多肽產品的穩定性。一旦打開, 應迅速稱量分裝完畢, 并立即密閉以免潮解,并將剩余多肽繼續儲存在-20°C或更低溫度。與其他多肽相比，含有半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和谷氨酸N -末端的多肽保存期更短 。

多肽溶液比干粉的穩定性差很多, 為了得到最好結果, 遵循下列原則:

a. 反復凍融有損于肽的活性, 所以建議分裝成小包裝保存。需要多少解凍多少, 用后剩余者棄掉。

b. 溶于PH5-7無菌的緩沖液中, 貯存于-20℃。 <

c. 包含Cys、Met、Tyr、Glu、Asp的多肽易于氧化, 因此須保存在無氧化劑的環境中。

d. 由于細菌能降解多肽, 因此儲存前必須過濾除菌

多肽的純度是指采用HPLC方法在214nm處檢測到的目標多肽的含量(214nm是肽鏈的吸收波長)，紫外分光光度計檢測不到水和殘留的鹽。可發現其他的雜質包括：缺失序列（缺失了一個或多個氨基酸殘基的靶序列），截斷序列（加帽過程中產生的序列）脫保護不完全序列（產生于整個合成過程或最后的裂解過程）。

多肽純化不涉及水和鹽。HPLC純化會產生少量的TFA，如：游離的氨基末端和其他側鏈如Arg、Lys、His都可生成少量TFA雜質。通常交付的多肽多含有微量TFA和殘留水。即使處于凍干狀態，水也會因共價結合的能力不同而不同程度地存在著。

肽凈含量不同于多肽純度，干品多肽的重量中不僅僅包含多肽，還包含有一些非肽的組份，如水，被吸收的溶劑、配位離子和鹽等。肽的凈含量是指肽在其中的重量百分比，這個百分比的數值范圍很大，可能從50%到90%，取決于純度、序列以及合成和純化的方法，不要將肽的凈含量和肽的純度混為一談，它們是完全不同的兩個概念。純度通常是由HPLC決定的。純度定義的是多肽樣品中含正確序列的組分的百分比，而肽的凈含量是指樣品中肽類物質相對于非肽類物質所占的百分比，肽的凈含量通常是用氨基酸組分分析或紫外分光法測定的。這個信息主要是在一些對肽的濃度很敏感的實驗中，對計算肽的濃度是很重要的。如果您需要這項服務（需要訂單中明確說明）。通常，親水性多肽即使在嚴格的凍干狀態下，也會吸收微量的水。因純化和凍干工藝，會導致不同批次的肽凈含量有所不同。

公司對客戶提供的所有材料均嚴格保密。在產品發貨前，我們同時提供HPLC和MS檢測結果。多肽公司所有多肽均采用反相色譜法純化。以質譜法測定肽的分子量來確定產品是否正確，MS檢測結果還可顯示大部份的主要雜質。如果必要，還可提供肽凈含量檢測（需要訂單中明確說明），如氨基酸分析或元素分析。這些方法可以證實多肽的氨基酸組成，他們均可作為多肽確認的補充方法。所有交付的肽均達到了客戶要求的純度。沒有達到純度要求的那些多肽均被丟棄。